Replikasjonsmønstre og organisering av replikasjonsgafler i Vibrio Cholerae

Abstract

Problemstillingen for denne oppgaven var å undersøke replikasjonsmønstre og organiseringen av replikasjonsgafler i Vibrio cholerae. Det ble også utført forsøk på hurtigvoksende kulturer av Escherichia coli. V.cholerae er en bakterie med et delt genom, der kromosom I er nesten tre ganger så stort som kromosom II. Under gunstige vekstforhold kan cellenes replikasjonsrunder overlappe, altså starter C-fase i foregående generasjoner. Cellene vil da kunne inneholde kromosomer med flere enn to replikasjonsgafler. En gaffel betegner et område der ny syntese av datterkromosomet finner sted. Denne egenskapen bidrar til å senke populasjonenes doblingstid. Her ble V.cholerae dyrket i tre forskjellige medier, de to første var ABB1 minimal medium supplementert med 0,2% glyserol eller 0,2% fruktose, og det tredje var LB. Disse var valgt for å gi stadig økende doblingstider, og det siste ga så hurtig vekst at replikasjonsrundene overlappet. For å undersøke replikasjonsmønstrene ble cellene fiksert og tilsatt Hoechst 33258 for farging av DNA. Histogram over fordelingene ble så målt med flowcytometri. Deretter ble det simulert teoretiske DNA fordelinger for ulike modeller av replikasjonsmønstre, og samsvaret med de eksperimentelle histogrammene ble vurdert. For cellene uten overlappende replikasjonsrunder ble det først forsøkt med to modeller for cellekinetikken i syklus som er tidligere foreslått i litteraturen. Disse er initieringssynkroni, der det store og lille kromosomet starter replikasjon samtidig, og termineringssynkroni, der kromosomene avslutter replikasjonen av DNA på likt. Den første modellen viste dårlig overensstemmelse med dataene og ble forkastet. Termineringssynkroni-modellen virket ganske korrekt, men et alternativ ble også fremlagt og kalt hoppkant-modellen. Navnet kommer av at i det eksperimentelle histogrammet kan det tydelig sees et fall i antall celler i C-fase. Dette kan være forårsaket av en økning i den totale replikasjonsraten, og teorien er således at kromosom II initierer ved dette punktet. Eventuelt kan også raten av DNA replikasjon være forskjellig for de to kromosomene, med en lavere rate for kromosom II vil hoppkant-modellen være forenelig med termineringssynkroni. Når kulturene ble dyrket i LB overlappet replikasjonsrundene. Her blir det vist at den beste tilpasningen gir en initiering av origin på kromosom I allerede to generasjoner før celledeling, i det som populært kalles bestemorgenerasjonen. Kromosom II ble funnet å starte replikasjon av DNA i foregående generasjon, og denne initieringen kan tenkes å være knyttet til replikasjonen av kromosom I. Kulturene ble i tillegg immunmerket for proteinet SeqA og fluorescensmikroskopert for å kunne telle opp fordelinger av disse fokusene. SeqA fokus representerer lokalisasjoner i cellen der det finnes en eller flere replikasjonsgafler. Videre ble også saktevoksende V.cholerae fra fruktosemediet sortert etter DNA innhold og deretter immunmerket. Denne kombinasjonen av metoder er ny, og bekreftet termineringssynkroni/hoppkant-modellen. For kulturene uten overlappende generasjoner så det ut til å være en stort sett parvis samlokalisering av replikasjonsgaflene. Andelen celler med to gafler passet bra med andelen med ett SeqA fokus, og prosentandelen med fire gafler var omtrent lik den med to eller tre fokus. At noen celler inneholdt tre fokus kan tyde på at samlokaliseringen av replikasjonsgaflene ikke er strikt, men heller en dynamisk prosess. Når doblingstiden minket og replikasjonsrundene overlappet, ble det funnet et gjennomsnittlig antall gafler per fokus på nesten 5 i cellene. Ut fra cellenes størrelse og fordelingene av gafler og fokus, kan det se ut som det også her eksisterer en tilnærmet parvis samlokalisering når cellene kun inneholder fire replikasjonsgafler. Etter videre initiering øker graden av gafler per SeqA struktur kraftig, og det foreslås at de nye gaflene også kan rekrutteres til allerede eksisterende komplekser. Dette tilsvarer observasjonene som ble gjort for hurtigvoksende E.coli celler.

The Vibrio cholerae genome is divided into two chromosomes (ChrI and ChrII). ChrII replication was first reported to initiate in synchrony with ChrI replication, but more recent results indicate termination synchrony for the two chromosomes in slowly growing cells (Rasmussen et al, 2007). We report here that the replication of Chr II was found to take place in the latter one-third of the Chr I replication period during both slow and rapid growth. The localization of replication forks was investigated by immunostaining with purified SeqA antiserum. Slowly growing cells sorted by FACS from the first part of C (with two Chr I forks) had a single SeqA focus. Most cells sorted from late C (replicating both chromosomes) had two foci. We therefore suggest that the two Chr I forks are co-localized in one SeqA focus and the two Chr II forks are co-localized in the other SeqA focus. Rapidly growing cells contained from one to six SeqA foci, with most cells containing 2 or 3 foci. In these cells the replication and segregation period (C+D) spanned three generations, resulting in initiation of Chr I at four origins and initiation of Chr II at two origins, and yielding a distribution of replication forks from four to 16. The results suggest that in young, rapidly growing cells two and two ChrI forks are co-localized. After initiation of replication more extensive co-localization is found. It is not clear whether ChrII forks co-localize with ChrI forks or whether mainly forks on the same DNA molecule co-localize. The increased degree of co-localization may be a means by which correct segregation of daughter molecules is facilitated.