Flow Cytometry Methods for DNA and Protein Analysis Using T-47D and T98G Human Cancer Cell Lines in Vitro

Abstract

I denne studien, var det to hovedmål: 1 - Å utvikle og etablere Vindeløv metoden for flowcytometrisk DNA-analyse, og deretter teste metoden på cellekulturer fra 2 cellelinjer utsatt for forskjellige behandlinger. 2 – Å utvikle og etablere en to parameter DNA- protein metode for flowcytometrisk målinger for å analysere både DNA innhold og protein mengden samtidig. Denne metoden ble også testet på cellekulturer med forskjellige forbehandlinger.

Den første metoden, Vindeløv, er en detergent - trypsin metode for å lysere celler og preparere kjernene for flowcytometrisk DNA-analyse. Denne metoden ignorerer mitokondrie-DNA og vurderer bare kjerne-DNA. Metoden bruker tre løsninger til farging; løsning A, B og C samt citratbuffer løsning. I tillegg til disse løsningene, brukes i den opprinnelige metoden PBS (1X) rense cellene. Denne metoden ble endret ved å endre eksponerings-tid, såpe type og konsentrasjon i løsning A samt utskifte PBS (1X) med 0,9% NaCl løsning. En kombinasjon av to såper, Tergitol og Triton - X 114 ble brukt til å erstatte NP-40 såpe brukt av Vindeløv i løsning A. Tiden i løsning A før løsning B ble tilsatt ble økt fra 10 minutter til 22 minutter.

Den andre metoden vurderer ikke bare kjerne-DNA, men også mitokondrie-DNA. Metoden tar tre dager. Første dag er fiksering av cellene i 50% etanol. Andre dag er farging av cellen i 0.1 mikrogram/ml FITC (fluorescein isothiocyanate) i mørke ved romtemperatur. Tredje dag er det farging først i 60 mikrogram/ml RNAase, og senere i 34 mikrogram / ml PI (propidium jodid) før flowcytometriske målinger starter.

Cellene som ble undersøkt var T-47D humane brystkreft celler og T98G humane hjerne kreft celler. Hver celle linje hadde sine derivater med forskjellig forbehandling. Disse cellene var:

• T98G LDRres (T98G lav doserate resistent): Celler som ble dyrket i [3H]-medium med en spesifikk aktivitet av 1,67 μCi / ml i 10 måneder.

• T98G - P (T98G-Primed): Celler som ble bestrålt med 0,3 Gy / t i en time før de ble dyrket i 9 måneder uten stråling.

• T-47D LDRres (T-47D Low doserate resistente celler): Celler som hadde vokst i [3H]-medium med en spesifikk aktivitet av 1,67 μCi / ml i 10 måneder

• T-47D - P (T-47-Primed): Celler som ble bestrålt med 0,3 Gy / t i en time før de ble dyrket i 4 år uten stråling.

• F10 (T-47D): Cellene som dyrket i [3H]-medium (0,46 ml [3H] i 150 ml) med spesifikk aktivitet på 1,6 μCi / ml i 5 måneder og 13 dager og deretter dyrket i 17 dager uten stråling før de ble frosset ned 17.02.2003.

• F44 (T-47D): Celler som ble dyrket i 4% hypoksi og i [3H]-medium med en spesifikk aktivitet på 1,67 μCi / ml i 35 dager og deretter dyrket i 45 dager uten hypoksi og stråling før de ble frosset ned 16.09.2009

Anvendelse av Vindeløv metoden til disse cellene ga følgende funn:

• T98G LDRes cellene hadde ca 30% mindre DNA-innhold i forhold til kontrollen, T-98G. Dette var det mest interesserante resultatetet av denne metoden.

• T-47D celler hadde ca 50 % mindre DNA –innhold i forhold til T98G celler.

• Behandling i 4% O2 og i [3H]-medium med en spesifikk aktivitet av 1,67 μCi/ml i 35 dager påvirket ikke DNA innholdet i F44 (T-47D) celler i forhold til cellene uten behandling i 4% O2 .

• Kvaliteten på DNA histogrammer og de tilsvarende G1-CVs (ned til 3,27 ± 0,01) ga tillit til metoden.

Anvendelse av DNA-Protein metoden på cellene ga følgende funn:

• En sub-populasjon av T98G-P celler ble observert som hadde samme DNA innhold, men mindre mengde protein i forhold til normal populasjonen. Dette var det mest interessante resultatet av denne metoden.

• T98G LDRres celler hadde ca 30% mindre DNA-innhold i forhold til T98G kontroll celler.

• Fiksering av T98G celler enten med 50% eller 70% ethanol medførte ingen forskjell i cellesyklus distribusjoner.

• Øking FITC konsentrasjon fra 0.1μg/ml til 1 mikrogram/ml gav upålitelige resultater.

In the present study, there were two main goals: 1- To develop and establish the Vindeløv method for flow cytometric DNA analysis, and test the method by applying it to cells with different characteristics and backgrounds. 2- Top develop and establish a method which could analyse both DNA content and amount of protein at the same time which is a two parameter DNA – protein method for flow cytometric measurements. This method was also tested by applying it to cells with distinct characteristics and backgrounds.

The first method, Vindeløv, is a detergent – trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. This method ignores mitochondrial DNA and considers only nuclear DNA. The method uses three staining solutions; solution A, B, and C and citrate buffer solution. In addition to these solutions, the original method used PBS to clean the cells. This method was altered by changing mainly staining time, soap type and concentration in solution A as well as exchanging PBS with 0.9 % NaCl salt, a combination of two soaps, Tergitol and Triton – X 114 were used to replace NP-40 soap used by Vindeløv in solution A. The staining time in solution A before solution B was added was increased from 10 minutes to 22 minutes.

The second method considers not only nuclear DNA but also mitochondrial DNA. The method takes three days. First day is fixation of the cells in 50 % rectified spirit (ethanol) in cold. Second day is staining of the cell in0.1 µg/ml FITC (fluorescein isothiocyanate) in the dark at room temperature. Third day is the staining first in 60 µg/ml RNase, and later in 34 µg/ml PI (Propidium Iodide) before flow cytometric measurements start.

The cells which were investigated were T-47D human breast cancer cells and T98G human brain cancer cells. Each cell line had its derivatives with distinct backgrounds. These cells were:

• T98G LDRres (T98G Low Dose Rate resistant): The cells which grown in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml for 10 months

• T98G – P (T98G -Primed): The cells which were irradiated with 0.3 Gy/h during 1 hour and then grown for 9 months without radiation.

• T-47D LDRres (T-47D Low Dose Rate resistant cells): The cells which were growth in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml for 10 months

• T-47D – P (T-47D-Primed): The cells which were irradiated with 0.3 Gy/h during 1 hour and then grown for 4 years without radiation.

• F10 (T-47D): The cells which were grown in [3H]-medium (0.46 ml [3H] in 150 ml) with a specific activity of 1.6 μCi/ml for 5 months and 13 days. Hereafter they were grown 17 days without radiation before they were frozen on 17.02.2003.

• F44 (T-47D): The cells which were grown in 4% hypoxia and in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml for 35 days. Hereafter they were grown for 45 days without hypoxia and irradiation until they were frozen on 16.09.2009.

Applying the Vindeløv method to these cells gave the following findings:

• T98G LDRes cells had approximately 30 % less DNA content compared to its control, T-98G. This was the most interesting result of this method.

• T-47D cells had nearly half the DNA content compared to that of T98G cells.

• The treatment of growing in 4% O2 and in [3H]-medium with a specific activity of 1.67 μCi/ml for 35 days did not affect the DNA content of the cells compared to that of the cells without 4% O2 treatment.

• The quality of the DNA histograms and the corresponding G1_CVs (down to 3.27 ± 0.01) increased confidence to rely on the method.

Applying the two-parametric DNA -Protein method to these cells gave the following findings:

• A sub population of T98G-P cells was observed which had the same DNA content but less amount of protein compared to wild-type T98G-P cells. This was the most interesting result of this project.

• As also found by the Vindeløv method T98G LDRres cells had approximately 30 % less DNA content compared to T98G control cells.

• Fixation of T98G cells either with 50 % or 70 % rectified spirit resulted in no difference in the cell cycle distributions.

• Increasing FITC concentration from 0.1µg/ml to 1 µg/ml gave unreliable results.